Česká zemědělská univerzita

Katedra genetiky a obecné zootechniky

Autor:

Kateřina Hamanová

Název:

Polymorfismus DNA se zaměřením na mikrosatelity u koní

(zkrácený obsah disertační práce – podklad pro seminář určený pro chovatelskou veřejnost)

Cíle:

Na základě vysoce polymorfních mikrosatelitních markerů, doporučených pro standardní protokol testování paternity u koní podle mezinárodních srovnávacích testů ISAG, 1997(98), byla charakterizována a porovnávána různá plemena koní se zaměřením na genové rezervy ČR.

Vybraný panel markerů byl ověřován u jednotlivých plemen z hlediska:

· jeho vypovídací schopnosti

· testování paternity pomocí sekvenátoru v našich podmínkách

· schopnosti stanovení odpovídajících hodnot heterozygotnosti a genetické distance.

Charakterizace současného stavu jednotlivých populací (plemen) na základě zjištěných heterozygotností a genetických distancí.

Co to je mikrosatelitní marker ?

· Mikrosatelitní DNA neboli mikrosatelity, také nazývané STR (short tandem repeats – krátká tandemová opakování), jsou krátké segmenty DNA, ve kterých se mnohokrát opakují specifické motivy nukleotidových sekvencí.

· Základem těchto repetitivních úseků jsou sekvence o velikosti od 1 do 4 až 6 bp.

· Motiv je obvykle opakován 60 krát a velikost jednotky se pohybuje zhruba v rozpětí 20 – 100bp.

· Typický sledovaný lokus má více než 10 alel.

· Heterozygotnost těchto lokusů je obvykle vyšší než 0.60, a to dokonce i v relativně malých skupinách zvířat.

· Díky jejich extrémní variabilitě (polymorfismu) a relativně snadné detekci, jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů.

· Navíc k jejich vysoké variabilitě, jsou mikrosatelity také velmi hojně rozšířené v eukaryotickém genomu, což je staví do pozice preferovaných markerů genetického mapování s vysokou citlivostí rozlišení.

· Ačkoliv se mikrosatelity vyskytují v genomu ve velkém množství, jejich biologická funkce je stále nejasná.

· V koňském genomu je jeden z nejhojněji zastoupených repetičních motivů (TG)n motiv, který vykazuje značně velký stupeň polymorfismu a jeho frekvence je odhadována zhruba 1 na 100 000 bp v genomu koní. Oproti tomu frekvence (TC)n repetic je vůči zmíněným (TG)n repeticím daleko nižší, i když jsou zhruba stejně polymorfní.

· Rozlišit určité mikrosatelitní jednotky v tomto množství nelze přirozeně, ani na základě charakteru motivu (ten je uniformní), ani na základě počtu repetic motivu (určitý počet se může v genomu opakovat třeba stokrát). Základní charakteristikou mikrosatelitů jsou proto jedinečné sekvence nukleotidů, přiléhající nebo vymezující mikrosatelitní sekvenci tzv. „flanking sequences„. Tyto přiléhající sekvence určují jedinečnou pozici mikrosatelitů v genomu.

· Každý jedinec má dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po matce, druhý po otci. To, že je délka každého mikrosatelitu děděna mendelisticky, dělá mikrosatelity ideálními polymorfními markery při mapování genomu, testování paternity a identifikaci.

· Mikrosatelity velmi rychle nahrazují metody spočívající na RFLP a RAPD (random amplified polymorphic DNA = náhodně amplifikovaná polymorfní DNA) ve většině aplikací v populační biologii, od identifikování příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů.

· Pomocí unikátních primerů je amplifikována, tedy zmnožena určitá oblast genomu, jež zahrnuje definovanou strukturu opakování, která je zodpovědná za sledovanou odchylku.

· Mikrosatelitní mapy jsou nyní dostupné téměř u všech organismů genetického a ekonomického zájmu, od člověka, myši, skotu, prasete, ovci, slepici, drozofilu, až po rajče, sóju, rýži a mnoho dalších.

· V kontrastu s jejich důležitostí ve vnitrodruhových studiích, mikrosatelity dosud nevytvořily žádný skutečný příspěvek pro fylogenetickou rekonstrukci.

C. Metodika

Bylo použito těchto 12 markerů (viz. tab), doporučených konferencí ISAG.

Lokus	Chromozom	Sekvence primeru
VHL20	30	5’-CAA GTC CTC TTA CTT GAA GAC TAG-3’ 5’-AAC TCA GGG AGA ATC TTC CTC AG-3’
HTG4	9	5’-CTA TCT CAG TCT TGA TTG CAG GAC-3’ 5’-CTC CCT CCC TCC CTC TGT TCT C -3’
HTG6	15	5’-CCT GCT TGG AGG CTG TGA TAA GAT-3’ 5’-GTT CAC TGA ATG TCA AAT TCT GCT-3’
HTG7	4	5’-CCT GAA GCA GAA CAT CCC TCC TTG-3’ 5’-ATA AAG TGT CTG GGC AGA GCT GCT -3’
HTG10	21	5’-CAA TTC CCG CCC CAC CCC CGG CA-3’ 5’-TTT TTA TTC TGA TCT GTC ACA TTT -3’
AHT4	24	5’-AAC CGC CTG AGC AAG GAA GT-3’ 5’-GCT CCC AGA GAG TTT ACC CT-3’
AHT5	8	5’-ACG GAC ACA TCC CTG CCT GC-3’ 5’-GCA GGC TAA GGG GGC TCA GC-3’
ASB2	15	5’-CCA CTA AGT GTC GTT TCA GAA GG-3’ 5’-CAC AAC TGA GTT CTC TGA TAG G-3’
HMS2		5’-CTT GCA GTC GAA TGT GTA TTA AAT G-3’ 5’-ACG GTG GCA ACT GCC AAG GAA G-3’
HMS3	9	5’-CCA ACT CCT TGT CAC ATA ACA AGA-3’ 5’-CCA TCC TCA CTT TTT CAC TTT GTT-3’
HMS6	4	5’-GAA GCT GCC AGT ATT CAA CCA TTG-3’ 5’-CTC CAT CTT GTG AAG TGT AAC TCA-3’
HMS7	1	5’-CAG GAA ACT CAT GTT GAT ACC ATC -3’ 5’-TGT TGT TGA AAC ATA CCT TGA CTG T -3’

Celkem bylo testováno 5 plemen koní (267 zvířat), která byla dále porovnávána s dalšími plemeny koní, uvedenými v literatuře, pomocí níže uvedených statistických ukazatelů, na základě jejich alelických frekvencí. Všechna tato plemena vzájemně vykazují více či méně rozdílů v tělesné stavbě, temperamentu, možnostech využití, … a původu.

Testovaná zvířata:

· SN … slezský norik - 39 ks, farma Klokočov na Moravě

(spol. PROMED OPAVA s.r.o.)

· LN … lánský norik - 16 ks, školní statek Lány

· A1/1 … anglický plnokrevník - 133 ks (různé)

· CT … český teplokrevník - 18 ks (různé)

· Z … zemaituka - 17 ks (Litva)

· H … hucul - 44 ks, - farma Hucul – Janova Hora (33)

- Hucul klub – Laka u Kokořína (11)

Dále na základě alelických frekvencí porovnáváno se zvířaty:

· QH … Quarter horse „čtvrtkař“ - 8850 ks (Bowling et al.,1997)

·

(Cothran et al., 1998)

KB … kladrubský bělouš - 87 ks

· KV … kladrubský vraník - 74 ks

· ECAtb … Equus Caballus – Thoroughbred =

(Breen et al., 1994)

domestikovaný kůň - plnokrevník - 90 ks …

· ECAmix … kříženci domestikovaného koně - 40 ks … ..

· EPR … kůň Převalského - 50 ks … … … … … … … …

Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) prováděné na automatickém termálním cykleru, bylo v multiplexních i jednoduchých polymerázových řetězových reakcích namnoženy (amplifikovány) dané DNA úseky za použití uvedených primerů .

Polymerázová řetězová reakce zahrnuje:

n horký start 10min. při teplotě 95°C

n 30 cyklů, kde byly prováděny všechny kroky po 1min.:

- denaturace při teplotě 93°C

- anelace při teplotě 55°C

- extenze při teplotě 72°C

n prodloužená extenze (anelace)

a) 10min. při teolotě 72°C – pro lokusy množené a typizované jednotlivě

b) 60 min. při teolotě 72°C – pro lokusy množené a typizované v multiplexu

n chlazení 4°C

DNA typizace jedinců

Zastoupení jednotlivých genotypů mikrosatelitů bylo zjišťováno pomocí automatického sekvenátoru ABI-PRISM 310 Perkin-Elmer, program GeneScan Analysys a princip typizace spočívá v:

1. Produktů PCR všech amplifikovaných lokusů se umístí do DNA sekvenátoru (tedy automatizovaného elektroforetického detektoru jedné linie). Vzorky DNA molekul díky elektrickému poli migrují od katody k anodě, skrze laserový detektor. GENESCAN software, běžící na PC značky Mackintosh, shromažďuje signály, a poté stanoví velikost (bp) pro každý vzorek. Data z GENESCANu jsou přímo exportována do software Genotyper pro automatickou genotypizaci. Pomocí více barevného fluorescenčního značení je umožněno vzorky hustě naskládat do multiplexu bez ohledu na to, zda-li se vzorky svými alelickými velikostmi překrývají. Pomocí interního standardu, který běží spolu se vzorky v každém běhu je pak docilována maximální přesnost při určování velikostí jednotlivých alel. Veškerá data jsou elektronicky uchovávána.

Tato DNA typizace byla prováděna v imunologické laboratoři ČMSCH s.r.o. v Hradišťku pod Medníkem.

Počet alel na lokus
Lokus	A1/1	SN	LN	Z	CT	H	Ř
VHL20	8	8	7	8	5	9	7,5
HTG4	5	4	4	6	3	6	4,7
AHT4	4	6	4	5	5	10	5,7
HMS7	5	6	5	4	7	7	5,7
HTG6	5	3	4	5	7	5	4,8
AHT5	6	7	6	3	5	7	5,7
HMS6	4	3	6	5	4	6	4,7
ASB2	13	6	5	5	8	7	7,3
HTG10	8	6	6	5	7	8	6,7
HTG7	6	4	4	4	4	5	4,5
HMS3	7	6	6	6	8	7	6,7
HMS2	6	6	7	5	6	5	5,8

Plemeno hucul vykazuje ve srovnání s ostatními testovanými plemeny vyšší hodnoty co do počtu zjištěných alel.

Z hlediska testování paternity (PE) vykazují uvedené markery jednu z nejvyšších pravděpodobností právě u plemene hucul, bez ohledu na to zda byli testováni oba rodiče, či pouze jeden z nich. (viz graf) PE – standardní ověřování na základě obou rodičů, obdobně jako novodobější metoda PE2, PE1 – testování paternity za nepřítomnosti jednoho z rodičů.

Průměrná heterozygotnost patří mezi ukazatele charakterizující stav heterozygotů v populaci. Jednoduše čím vyšší je uvedené číslo tím lépe. Hodně zjednodušeně řečeno, existují jisté hladiny tohoto parametru při jejichž naplnění můžeme považovat populaci z hlediska inbrední deprese ve stavu nedotčeném příbuzenskou plemenitbou a na naopak. Takovými hladinami jsou pro hodnoty průměrné He u mikrosatelitů 0,8 a 0,5. Z toho vyplývá pro plemeno hucul velmi dobrý výsledek na rozdíl třeba od kladrubského vraníka, kde hodnoty jednoznačně potvrdily skutečnost značného vlivu příbuzenské plemenitby, apod. Samozřejmě to nemůžeme brát za dogma, protože v takovém případě by bylo třeba sledovat daleko větší počet markerů.

¨Tři varianty heterozygotností H – standardní heteroz. na základě alelických frekvencí, DC – heteroz. vycházející přímo z heterozygotních jedinců a H* - nevychýlená heteroz. zameřená na skupiny s malým počtem testovaných zvířat.

Ukazatelem porovnávajícím plemena jsou genetické distance. Celá řada takovýchto parametrů existuje, z nichž každý vyhovuje trošku jiným podmínkám. V našem případě se ukázala jako nejméně vychýlená distance od NEIE 1972.

A spolu s UPGMA metodou shlukování pak vytváří následující dendrogram. Pro fylogenetické stromy není 12 markerů příliš mnoho, nicméně vzhledem k ceně stanovení musí pro orientaci postačit.

Populace	A1/1	SN	LN	Z	CT	H	KB	KV
A1/1	*****	0,020	0,003	0,026	0,017	0,017	0,021	0,033
SN	0,547	*****	0,014	0,014	0,012	0,019	0,033	0,030
LN	0,486	0,122	*****	0,021	0,006	0,016	0,032	0,024
Z	0,694	0,405	0,377	*****	0,021	0,016	0,038	0,030
CT	0,153	0,407	0,371	0,546	*****	0,014	0,018	0,035
H	0,447	0,352	0,293	0,479	0,414	*****	0,018	0,021
KB	0,568	0,409	0,484	0,488	0,411	0,564	*****	0,021
KV	0,672	0,371	0,512	0,434	0,621	0,594	0,273	*****

Tento složitější dendrogram pak vychází z méně početného panelu markerů, zato jsou v něm zahrnuta i další plemena. Obdobně jako na předešlém i zde je postavení hucula nevýrazné a pro přesně jší určení by bylo skutečně potřeba daleko více markerů.

Zveřejněno s laskavým souhlasem autorky.